高架式十字迷路試験（Elevated Plus Maze、EPM。エレベイテッドプラスメイズとも呼ばれます）は、オープンフィールド試験と並んで、不安様行動を評価する試験の定番です。装置は十字型で操作もシンプルですが、解析の段階になると「進入の定義をどう決めるか」「区画をどう設定するか」で迷う人が多い試験でもあります。
この記事では、高架式十字迷路試験の仕組みと方法、主要な指標の定義と計算式、そして解析に必要な機能を整理します。手動計測と自動解析の違い、無料でできる範囲、区画設定が複雑になりやすいこの試験特有の注意点も扱います。
高架式十字迷路試験とは
高架式十字迷路試験は、高所の十字型の装置にマウスやラットを入れ、壁のない通路をどれだけ避けるかから不安様行動を評価する試験です。4本のアームのうち、向かい合う 2本が壁のない開放アーム（open arm）、残りの 2本が壁で囲まれた閉鎖アーム（closed arm）で、中央の区画（center）が 4本をつなぎます。高さはプロトコルによって異なります（例：ラット用 50cm、マウス用 40〜50cm。文献 3、4）。
試験では動物を中央の区画に置き、決めた時間（例：5分間。文献 3）、どのアームに何回入り、どれだけ留まったかを記録します。主な評価指標は、開放アームの滞在時間比率と進入回数比率、総進入回数です。開放アームへの滞在や進入が少ないほど、不安様行動が強いと解釈します。Pellow らが 1985年にラットでこの試験の妥当性を検証し（文献 1）、1987年に Lister がマウスでの使い方を報告しました（文献 2）。
この装置が利用しているのは、げっ歯類が持つ2つの相反する性質です。ひとつは、高所や開けた空間、壁のない場所を避ける性質。もうひとつは、新しい環境を探索したいという性質。この2つがせめぎ合った結果として、動物がどれだけ開放アームに出ていけるかが、不安様行動の指標になります（文献 4）。
不安が強い個体は、閉鎖アームに留まりがちです。Pellow らの検証では、臨床で効果のある抗不安薬（ベンゾジアゼピン系など）で開放アームでの滞在や進入の割合が増え、不安を起こす薬物で減りました（文献 1）。このため、EPMは抗不安薬のスクリーニングに使われてきました。ただし開放アームの指標は、運動量や鎮静作用、照度、系統、性別、試験の経験などにも左右されるため、変化をそのまま不安の増減とは読めません。
オープンフィールド試験が「中心か外周か」で不安をみるのに対し、EPMは「高所の開けた場所に出られるか」という回避行動をみる試験です。両方を組み合わせて使う研究もあります。
試験の方法（馴化・置き方・試験時間・清掃）
手順は研究室によって異なります。ここでは 2つのプロトコル（文献 3、4）を例に、結果を左右しやすい点をまとめます。
馴化 試験の前に、動物を試験室へ移して環境に慣らします。Komada らのプロトコルでは、最初の試行の 30分前に移しています（文献 4）。業者から購入した動物は、輸送のストレスの影響を避けるため、少なくとも 1週間飼育してから試験に使うよう勧められています（文献 3）。
置き方 動物は中央の区画に、毎回同じ向きで置きます。開放アームに向けて置くプロトコル（文献 3）と、閉鎖アームに向けて置くプロトコル（文献 4）があり、向きによって結果が変わりうるため、すべての個体で向きと扱い方をそろえます（文献 3）。
試験時間 Walf と Frye のプロトコルは 5分間（文献 3）、Komada らのマウスのプロトコルは 10分間です（文献 4）。ほかの研究と比べるときは試験時間を確かめてください。どちらのプロトコルも、1匹につき試験は 1回です（後述の「同じ個体での繰り返しには注意する」を参照）。
清掃 1匹ごとに装置を清掃し、乾かしてから次の個体を試験します（文献 3）。前の個体のにおいが次の個体の行動に影響するのを防ぐためです（文献 4）。
高架式十字迷路試験の評価指標
EPMでよく算出する指標は、open arm（開放アーム）の滞在時間比と進入回数比、総進入回数です。それぞれの定義を整理します。
開放アーム滞在時間比率（% time in open arms） 試験時間のうち、開放アームに滞在していた時間の割合。もっとも基本的な不安様行動の指標です。「開放アーム滞在時間 ÷（開放アーム滞在時間＋閉鎖アーム滞在時間）」で算出するのが一般的で、中央部の滞在時間を分母に含めるかどうかはプロトコルによって異なります。
開放アーム進入回数比率（% open arm entries） 総進入回数のうち、開放アームへの進入が占める割合。滞在時間と並ぶ主要指標です。
総進入回数（total arm entries） 開放・閉鎖を問わず、アームへの進入回数の合計。不安様行動そのものではなく、動物の自発運動量を反映する指標として使われます。鎮静作用のある薬物を投与すると、不安が変化していなくても総進入回数が落ちることがあるため、この指標を併記することで、結果が「不安の変化」なのか「単なる運動量の低下」なのかを切り分ける手がかりになります。
閉鎖アーム進入回数（closed arm entries） 総進入回数の代わりに、閉鎖アームへの進入回数だけを運動量の指標として使う研究もあります。開放アームへの進入は不安の影響を受けるため運動量の指標としては不向きですが、閉鎖アームへの進入は不安の影響を受けにくいという考え方によるものです。
各指標の計算式を表にまとめます。滞在時間と進入回数は、いずれもアームごとに数えた値から計算します。
| 指標 | 計算式 | 何をみるか |
|---|---|---|
| 開放アーム滞在時間比率（% time in open arms） | 開放アーム滞在時間 ÷（開放アーム滞在時間＋閉鎖アーム滞在時間）× 100 | 不安様行動（値が大きいほど不安様行動が弱い） |
| 開放アーム進入回数比率（% open arm entries） | 開放アーム進入回数 ÷（開放アーム進入回数＋閉鎖アーム進入回数）× 100 | 不安様行動（値が大きいほど不安様行動が弱い） |
| 総進入回数（total arm entries） | 開放アーム進入回数＋閉鎖アーム進入回数 | 運動量（対照の指標） |
| 閉鎖アーム進入回数（closed arm entries） | 閉鎖アームへの進入回数 | 運動量（対照の指標） |
滞在時間比率は、分母に中央の区画の滞在時間を含めて、試験時間全体で割る場合もあります。どちらの式を使ったかは、次の節の進入の定義とあわせて論文に明記してください。
進入の定義と区画設定（四肢基準か重心基準か）
進入回数は、何をもって「アームに入った」とみなすかで値が変わります。ここでは代表的な 2つの基準を示します。
四肢基準 四肢すべてがアームに乗った時点を進入とみなします。観察者が目で数える手動観察で使われてきた基準で、Walf と Frye のプロトコルも、開放アームへの進入をこの基準で数えています（文献 3）。
重心基準 動物の体の中心（重心）がアームに入った時点を進入とみなします。Komada らのマウスのプロトコルは、この定義を使っています（文献 4）。
自動解析ソフトの判定も一様ではなく、ソフトや設定によって、体の中心で判定するもの、四肢や鼻先など体の部位の位置で判定するものがあります。同じ動画でも、基準によって進入回数の値が変わりえます。中央の区画をどこまで取るかでも、アームに入ったと判定される時点が変わります。論文に記載する際は、どの基準を使ったかを明記する必要があります。
EPMの解析で最初につまずくのは、多くの場合この区画設定です。
オープンフィールド試験なら区画は「中心」と「外周」の2つですが、EPMは開放アーム2本、閉鎖アーム2本、中央、で合計5つの区画を設定する必要があります。
装置がカメラに対してきれいに正対していて、4本のアームが画面の縦横にまっすぐ伸びているなら、矩形を5つ並べるだけで区画を作れます。問題は、実際の実験室ではそうならないことが多い点です。
装置は床や台に先に固定されていて、カメラの位置は天井の構造や照明の配置に制約されます。結果として、画面の中で十字が少し傾いて写ることは珍しくありません。この状態で矩形の区画を当てはめようとすると、アームの実際の範囲と区画がずれます。傾きが大きいほど、アームの外側が区画から漏れたり、逆に隣の領域を巻き込んだりします。
もうひとつ厄介なのが、中央部が円形の装置です。十字の交差部分を円形にした装置は一般的ですが、円形の中央部と、そこから伸びる矩形のアームの境界をどう引くかは、矩形と円だけでは扱いにくい問題です。隙間ができないように配置しようとすると、今度は区画同士が重なってしまう。重なった部分の滞在時間がどちらの区画に計上されるのかが曖昧になり、結果の解釈に影響します。
区画をどう定義するかで、結果が変わります。中央部をどこまでアームに含めるか、アームの先端まで含めるか。これも中心区画の定義と同様、研究室やプロトコルによって幅があり、論文には定義を明記する必要があります。
だからこそ、区画を柔軟に設定できるツールであることが重要になります。5つの区画をそれぞれ独立して設定でき、装置の実際の写り方に合わせて境界を調整できる。この自由度が、EPMの解析ツールを選ぶうえでの実質的な判断基準になります。
手動計測と自動解析はどう違うか
高架式十字迷路試験の解析には、大きく 2つのやり方があります。
ひとつは、観察者が試験中に、または録画を見ながら、ストップウォッチとカウンターで各アームの滞在時間と進入回数を記録する方法。もうひとつは、動画から動物の位置を自動で追跡し、区画ごとの滞在時間と進入回数を計算する方法です。
手動計測は、装置さえあれば追加の費用がかかりません。開放アームの縁から頭を下げて外を覗く動作（head dipping）のような、姿勢を伴う行動も観察者が数えられます。ただし、いくつかの弱点があります。
1匹ずつ試験時間いっぱい見続けるのは負担が大きく、集中力の低下が誤差につながります。四肢がそろってアームに乗ったかどうかの判定は計測者によってぶれやすく、評価者間のばらつきも避けられません。観察者が装置のそばにいる場合は、物音や動きで動物の行動に影響を与えないよう注意も要ります（文献 3）。
自動解析は、動物の位置を座標として記録し、決めた区画と進入の基準を全個体に同じように当てはめます。同じ設定を別の動画にも再び当てはめやすく、計測者の間のばらつきを抑えやすくなります。ただし、見失いや影の誤認などの追跡の誤りは残るため、追跡の精度は一部の動画を目で見て確かめる必要があります。Walf と Frye のプロトコルは、ビデオ追跡と観察者の記録を並行して行っています（文献 3）。
注意したいのは、進入の基準がソフトや設定によって異なる点です。使うソフトがどの基準で判定しているかを確かめ、四肢基準で手動計測した過去のデータと比べる場合は、一部の動画で両方の値を並べて差の大きさを確かめておくと安心です。
高架式十字迷路の解析に必要な機能
オープンフィールド試験と同様、EPMの主要指標も、動物の中心点を1点として追跡できれば算出できます。
滞在時間は、中心点がどの区画にあったかの時間集計。進入回数は、中心点が区画の境界を越えた回数。いずれも「動物が平面上のどこにいるか」だけで成立します。
例外は、リスクアセスメント行動と呼ばれる一群の指標です。開放アームの入口で頭だけを伸ばして様子をうかがう「head dipping（頭を下げて外を覗く動作）」や、体を伸ばして探る「stretch-attend posture」は、中心点だけでは捉えられません。鼻先の位置や体の伸展を個別に追跡する、より詳細な姿勢推定が必要です。これらは補助的な指標として扱われることもありますが、研究目的によっては重要になります。
主要指標（滞在時間、進入回数）だけが目的なら、中心点の追跡でも算出できます。ただし、中心点で判定した進入回数は体の中心による値になり、四肢基準の値とは一致しないことがあります。この点は、オープンフィールド試験の解析方法で整理した考え方と同じです。
無料ツールでどこまでできるか
EPMの主要指標に限れば、無料のツールでも算出できます。
国内で使われている行動解析君（Mr. Behavior）のTrackerは、ROI（関心領域）を自由に設定できる設計で、高架式十字迷路にも対応しています。5つの区画を自分で定義し、Windows環境があれば滞在時間や進入回数を算出できます。
無料ツールから始めるのが合理的なのは、以下に当てはまる場合です。
- 必要な指標が、開放アーム滞在時間比率・進入回数比率・総進入回数など基本的なもの
- 研究室にWindows PCがある
- 解析する動画の本数が限られている
- 5つの区画を手作業で設定する時間を割ける
区画の再設定が頻繁に必要（撮影条件が動画ごとに微妙に異なる、複数の装置を併用しているなど）な場合や、Windows環境がない場合は、次の選択肢が視野に入ります。無料ツールを含めた費用構造は、行動解析ソフトの価格比較記事にまとめています。進入の判定方式や姿勢推定の有無など、機能から製品を選ぶ場合は、行動解析ソフトの選び方と比較をご覧ください。
Be-Chaseで高架式十字迷路を解析する
この記事を掲載しているのはBe-Chaseの運営元です。以下は自社サービスの説明にあたります。
Be-Chaseは、動画をアップロードするだけで行動解析ができるクラウド型のサービスです。EPMの主要指標は、いずれも標準機能でカバーしています。
区画は、矩形と円形に加えて多角形でも描けます。EPMのように開放アーム・閉鎖アーム・中央で合計5つの区画が必要な試験でも、それぞれに名前をつけて個別に設定できます。
多角形が使えることは、EPMでは実用上の意味があります。前述のとおり、装置がカメラに対して傾いて写っている場合、矩形ではアームの範囲を正確に囲えません。多角形なら、画面上の実際の写り方に沿って頂点を置けるため、傾きをそのまま吸収できます。中央部が円形の装置で、アームとの境界に隙間や重なりを作らずに区画を並べたい場合も同様です。
設定した各区画について、滞在時間と進入回数が数値化され、結果はCSVと画像で出力されます。Be-Chaseの進入の判定は、ターゲットを 1点（中心点）として追跡し、その点が区画の境界を越えた時点を基準としています。四肢や鼻先の位置では判定しません。手動観察の「四肢すべてが入った時点」とは基準が異なるため、過去の手動計測データと直接比較する場合はご注意ください。
操作の手順は、マニュアルのチェックエリアを設定する（5つの区画の描き方と名前の付け方、多角形の使い方）、縮尺を設定する（移動距離をcmで出す）、解析結果の見方（CSVの区画ごとの滞在時間と出入りの記録の読み方）にまとめています。
なお、Be-Chaseは中心点による追跡が基本のため、head dippingやstretch-attend postureのような、鼻先の動きを伴うリスクアセスメント行動の検出には対応していません。主要指標（滞在時間比率、進入回数比率、総進入回数）だけで解析が完結する研究に向いています。より詳細な姿勢を伴う指標が必要な場合は、DeepLabCutのような姿勢推定ツールが選択肢になります。
クラウド型のため、Windows PCや専用の解析装置は必要ありません。iPhoneやiPadで撮影した動画をそのままアップロードして解析できます。
抗不安薬の評価に使うときの注意点
EPMは薬理学的な評価によく使われます。その場合、ベースライン、時間帯、個体差をはじめ、いくつか気をつけておきたい点があります。
ベースラインは同じ条件の対照群で押さえる 開放アームでの滞在や進入の基準値（ベースライン）は、系統や性別、週齢によって異なります（文献 3）。薬物の効果は、系統・性別・週齢をそろえた溶媒投与群（vehicle）と比べて判断してください。
試験の時間帯をそろえる 高架式十字迷路での行動は、概日リズムや明暗周期の影響を受けます（文献 3）。明暗周期のどの時間帯に試験するかを決め、群の間で時間帯が偏らないようにします。群の間で試験の順番を入れ替える（カウンターバランスをとる）と、順番や時間帯の影響が一方の群に偏るのを防げます（文献 4）。
個体差の要因をそろえ、記録する 雌を使う場合は、性周期によって結果が変わりうるため、性周期の段階を考慮することが勧められています（文献 3）。試験前の扱い（ハンドリング、輸送、注射など）の経験も反応を変えうるので、群の間でそろえます（文献 3）。
総進入回数を必ず併記する 開放アーム滞在時間や進入回数比率だけを見ると、「不安が減った」のか「単に動かなくなった／活発になった」のかが区別できません。総進入回数（または閉鎖アーム進入回数）を運動量の対照指標として、必ず一緒に報告してください。
同じ個体での繰り返しには注意する EPMは、動物が一度経験すると、2回目以降は反応が変わりうる（one-trial tolerance）ことが知られています（文献 2）。同一個体を繰り返し使う縦断的な評価では、この影響に注意が要ります。
照明条件を一定にする 照度が開放アームでの行動に与える影響は、研究や条件によって報告が分かれます（Pellow らのラットの検証では、照度は有意な要因ではありませんでした。文献 1）。実験群と対照群で照度をそろえ、条件の違いが結果に混ざらないようにしてください。
撮影時に気をつけたいこと
EPMは装置が高い位置にあるため、オープンフィールド試験とは異なる撮影上の注意点があります。
開放アームの縁まで正確にフレームに収める 壁がないため、動物がアームの縁に近づいたときの追跡精度が結果に直結します。カメラの画角に、開放アームの先端まで余裕を持って収めてください。
真上からの固定撮影を徹底する 十字型の装置は、斜めからの撮影だと4本のアームの見え方が均等になりません。真上からの撮影が、他の試験以上に重要になります。
振動対策をする 高い位置に設置された装置は、床の振動や空調の風で揺れやすくなります。カメラも装置も、しっかり固定してください。
撮影した動画の条件は、動画適性チェッカーで事前に確認できます。開放アームの縁での追跡精度は撮影条件に左右されるため、本番の撮影前にテスト撮影で試しておくと確実です。
まとめ
- EPMは、開放アームへの回避行動を通じて不安様行動をみる試験。抗不安薬の評価に広く使われる
- 試験時間や置く向きはプロトコルによって異なる（例：5分間・開放アーム向き、10分間・閉鎖アーム向き）。馴化、置く向き、清掃の手順は全個体でそろえる
- 主要指標は、開放アーム滞在時間比率・進入回数比率・総進入回数。進入の定義は論文に明記する
- 総進入回数（または閉鎖アーム進入回数）は、運動量の対照指標として必ず併記する
- 区画設定が5つ（開放アーム×2、閉鎖アーム×2、中央）と多い。装置がカメラに対して傾いて写る場合や、中央部が円形の装置では、矩形だけでは正確に囲えないことがある
- 主要指標は中心点の追跡でも算出できる（進入は体の中心による値になる）。head dippingなど一部のリスクアセスメント行動は、より詳細な姿勢推定が必要
- 基本指標に限れば、行動解析君などの無料ツールでも算出できる
- 動物は一度EPMを経験すると反応が変わりうるため、同一個体を繰り返し使う評価には注意が要る
EPMは装置がシンプルな分、区画設定と指標の定義をどう決めるかが解析の質を左右します。まず何を測りたいかを決め、そのうえで、自分の実験室での装置とカメラの位置関係でも正確に区画を引けるツールを選んでください。
参考文献
- Pellow, S., Chopin, P., File, S. E. & Briley, M. Validation of open:closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat. J Neurosci Methods 14, 149–167 (1985). https://doi.org/10.1016/0165-0270(85)90031-7
- Lister, R. G. The use of a plus-maze to measure anxiety in the mouse. Psychopharmacology (Berl) 92, 180–185 (1987). https://doi.org/10.1007/BF00177912
- Walf, A. A. & Frye, C. A. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents. Nat Protoc 2, 322–328 (2007). https://doi.org/10.1038/nprot.2007.44
- Komada, M., Takao, K. & Miyakawa, T. Elevated plus maze for mice. J Vis Exp (22), 1088 (2008). https://doi.org/10.3791/1088
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